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Cell Therapy 관련 자주 묻는 질문과 그에 대한 답을 확인해보세요.

  • [Percoll] Percoll 을 목적 밀도로 조제하는 방법 (희석 방법)은 무엇인가요?
    Percoll 을 목적하는 밀도에 맞게 희석하는 방법은 두 가지가 있습니다.
    1) Percoll 원액과 10X Buffer 혹은 10X Media 를 9:1 비율로 혼합하여 Percoll Stock Solution (100% Percoll) 을 조제하고, 만든 Percoll Stock Solution 을 1X Buffer 혹은 1X Media 를 이용하여 목적하는 밀도까지 희석합니다.
    2) 메스 실린더에 Percoll 원액 과 10X Buffer 혹은 10X Media 를 넣고, 증류수로 목표하는 밀도 및 용량까지 증류수로 희석합니다.
    아래 링크의 Percoll Calculator 를 이용해, 앞서 소개한 방법 중 2번 방법을 통해 제조할 때 필요한 Percoll 원액, 10X Buffer, 10X Media 및 증류수의 양을 간단하게 계산할 수 있습니다.
    https://www.cytivalifesciences.com/en/us/support/online-tools/cell-preparation/percoll-calculator
    자세한 공식은 아래의 제품 설명서를 참조하세요.
    https://cytiva-delivery.sitecorecontenthub.cloud/api/public/content/digi-14807-pdf
  • [Ficoll] Ficoll Paque Plus 로 인간 이외의 동물로 혈액에서 림프구를 분리할 수 있나요?
    Ficoll Paque 는 인간 말초 혈액으로부터 림프구를 분리하기 위한 특정 밀도인 1.077 g/mL 의 밀도를 갖고 있습니다. 혈액을 채취한 종에 따라 림프구의 밀도가 달라지게 됩니다. 때문에, 인간 이외의 생물 샘플을 처리할 때는 Percoll 사용을 권장합니다. Percoll 을 원하는 밀도로 직접 준비하여 사용할 수 있습니다.
    작은 동물 (쥐 혹은 마우스)의 림프구 분리에는 Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 사용이 가능합니다.
  • [Percoll] Percoll 과 Percoll plus 의 차이점은 무엇인가요?
    Percoll Plus 는 Percoll 의 개량 제품입니다. 기존의 Percoll 의 특징은 Percoll Plus 에서 모두 계승하였기 때문에, Percoll Plus 를 Percoll 과 동일하게 사용이 가능합니다.
    Percoll plus 의 성분은 Percoll 과 다르며, silane 이 Silica Particle 과 공유 결합되어 있기 때문에 보다 높은 안정성을 가집니다. 때문에, 목표하는 밀도로 제조한 이후에도 멸균이 가능합니다.
    또한, Percoll Plus 는 제품 출하 시 내독소(Endotoxin) 시험을 실시하고 있습니다.
  • [Percoll] 논문 등에서, Percoll 의 밀도(비중)에 대해 20% Percoll 혹은 50% Percoll 이라고 기재되어 있습니다. 이 경우의 조제 방법은 무엇인가요?
    Percoll 용액은 아래와 같이 준비할 수 있습니다.
    1) Percoll 원액과 10X Buffer 혹은 10X 배지를 9:1 비율로 혼합하여 Percoll Stock Solution 을 조제합니다.
    2) 1에서 제조한 Percoll Stock Solution 을 100% Percoll 로 산정하고, 목표하는 농도에 맞게 1X Buffer 혹은 1X 배지로 희석하여 조제합니다.
  • [Percoll] 원심 분리 후 Percoll 을 어떻게 제거하나요?
    Percoll 은 생체에 독성이 없으며, 세포막에 부착하지 않기 때문에 분리한 용액에서 제거할 필요는 없습니다. 하지만 필요하다면 아래의 세 가지 방법 중 하나를 통해 분리가 가능합니다.

    1) 세정법 (저속 원심법)
    살아있는 세포에서 Percoll 을 분리하려면, 세포 현탁액 1 부피 당 생리식염수 5 부피를 넣고, 200 g 에서 2분 ~ 10분간 원심 분리하여 세포를 회수하는 작업을 2회에서 3회 수행합니다.

    2) 고속 원심 분리법
    바이러스 및 준세포 과립은 세포에 비해 작기 때문에, 방법 1과 같은 저속으로 원심 분리를 진행하게 되면 침전하지 않습니다. 따라서, 고속 원심분리기를 이용하여 수평 로터의 경우에는 100,000g 에서 2시간, 혹은 앵글 로터로 100,000g 에서 90분 동안 원심 분리를 수행하여 Percoll 을 침전시킵니다. 이후, 침전된 Percoll 펠렛 위의 준 세포 과립을 회수합니다.

    3) 크로마토그래피법
    크로파토그래피법을 이용하면 Percoll 을 완전히 제거하는 것이 어렵지만, Sepharose 2B 혹은 4B 를 이용한 젤 필터 크로마토그래피를 이용해 큰 입자 (바이러스 등)에서 Percoll 을 분리할 수 있습니다. 또한, Percoll 은 비하전성(uncharged) 이기 때문에 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하면 Percoll 을 용출해 제거할 수 있습니다.
  • [Ficoll] Ficoll-Paque Plus 와 Percoll 의 차이점은 무엇인가요?
    Ficoll Paque Plus 는 인간 말초 혈액 (Human Peripheral blood) 에서 림프구를 분리하기 위해, 밀도를 1.077 g/mL 로 맞추어 제조한 제품으로 그대로 사용이 가능합니다.
    Percoll 은 분리하고자 하는 세포를 림프구로 한정하지 않고, 다양한 세포의 분리에 사용할 수 있도록 만들어져 있습니다. 분리하고자 하는 세포의 밀도에 맞추어 Percoll 을 특정 밀도로 조제하여 사용합니다.
  • [Ficoll] Ficoll-Paque Plus 의 조성은 무엇인가요?
    100 mL 의 Ficoll-Paque Plus 수용액은 아래 성분으로 구성되어, 1.077 g/mL 의 밀도를 가집니다:
    Ficoll PM 400 - 5.7 g
    Sodium diatrizoate - 9 g
    EDTA - 0.0231 g

    Ficoll PM 400 은 sucrose 와 epichlorohydrin 을 가교결합한 분자량 약 400,000 의 수용성 고분자입니다.
    Sodium diatrizoate 는 수용액의 비중을 적절하게 조절하기 위해 첨가된 성분입니다.
  • [Ficoll] Ficoll-Paque Plus 로 인간 림프구를 분리하였을 때, 적혈구 및 과립구 오염이 많습니다. 어떤 방법을 통해 개선할 수 있을까요?
    다음과 같은 원인으로 인해 발생할 수 있습니다.

    1. 원심 분리 온도가 너무 높은지 확인이 필요합니다.
    Ficoll-Paque Plus 는 온도가 높아지면 밀도가 낮아지게 되므로, 림프구를 분리하기 위한 밀도보다 낮아지게 됩니다.
    또한, 높은 온도는 세포의 Viability 에도 큰 영향을 미치기 때문에, 18 ~ 20 ℃ 에서 분리를 수행하는 것을 권장합니다.

    2. 원심 분리 속도가 느리거나, 원심 분리 시간이 짧습니다.
    림프구 이외의 세포를 완전히 침강시키기 위해서는, 원심 분리 시간 및 속도가 적절해야 합니다. 사용하는 로터의 크기와 원침관의 각도에 따라 침강 상태가 달라지므로, 사용하는 로터에 따라 최적의 조건을 설정해야 할 수 있습니다.
  • [Ficoll] Ficoll-Paque Plus 로 인간 림프구를 분리하였을 때 회수율 및 viability 가 낮습니다. 어떤 방법을 통해 개선할 수 있을까요?
    원심 분리 온도가 너무 높은지 확인이 필요합니다.
    Ficoll-Paque Plus 는 온도가 높아지면 밀도가 낮아지게 되므로, 림프구를 분리하기 위한 밀도보다 낮아지게 됩니다.
    또한, 높은 온도는 세포의 Viability 에도 큰 영향을 미치기 때문에, 18 ~ 20 ℃ 에서 분리를 수행하는 것을 권장합니다.
  • [Ficoll] Ficoll-Paque Plus 를 이용해 인간 환자 혈액으로부터 림프구를 분리할 수 있을까요?
    Ficoll-Paque Plus 는 인간 말초 혈액에서 정상 림프구를 분리하기 위해 개발된 밀도 구배 배지입니다. 환자 인간 혈액에서의 림프구 분리는 질병 종류 및 정도에 따라, 혈액 시료에서 림프구의 침강 정도가 달라질 수 있습니다.
    따라서, 질병이 없는 인간의 혈액으로부터 얻은 수율을 환자 혈액에서 얻기는 어려울 수 있습니다.
    환자 혈액 혹은 말초 혈액이 아닌 샘플은 Percoll 을 사용하는 것도 다른 방법이 될 수 있습니다.

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