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Chromatography 관련 자주 묻는 질문과 그에 대한 답을 확인해보세요.

  • ÄKTA를 사용해서 정제할 때 유용한 connectors를 소개해 주세요.
    [ÄKTA Accessories 어플의 Fittings에서 더 많은 connectors를 확인하시기 바랍니다.

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  • HiTrap column으로 정제할 때 사용하는 connectors를 소개해 주세요.
    AKTA Accessories 어플의 Fittings에서 더 많은 connectors를 확인하시기 바랍니다.

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  • GST-tagged protein을 어떻게 정제할 수 있을까요?
    [GST-tagged Protein의 정제과정]

    [1] 정제도
    • PreScission Protease를 사용해서 GST-tagged proteins을 정제하는 방법
    gst2
    • Thrombin이나 Factor Xa을 사용해서 GST-tagged proteins을 정제하는 방법
    gst1 * 이미지 크게 보기

    [2] Cleavage enzyme에 따른 구분

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    더 자세한 내용은 자료실-Chromatography 페이지의 Affinity Chromatography vol.2 핸드북의 chapter 5를 참고하시기 바랍니다.
  • Sephadex resin을 어떻게 사용할 수 있는지 알려주세요.
    Cytiva 실험길라잡이 자료실 내 Chromatography 페이지의 [All about Sephadex 설명서]를 참고하세요.

    바로 가기
  • Buffer 가 부족하여, Column 이 완전히 Dry 되었습니다. Column 을 재 사용 할 수 있을까요?
    어떠한 종류의 Column도 Dry 되기 전의 Column Performance를 재현하기가 매우 힘듭니다. Gel filtration (GF) Column 의 경우, Packed Bed의 상태에 따라 크로마토그램의 분리능에 큰 영향을 주는 Chromatography column이기 때문에, 레진이 Dry 되면 Packed Bed에 Cracking을 형성 할 수 있어서, 재 기능을 잃을 수 있습니다. 그렇기 때문에, Re-Packing을 추천 드립니다. Cracking 의 형성은 또한, Ion Exchange chromatography (IEX)와 Affinity chromatography (AC) 에도 영향을 줍니다. 재 사용을 원하실 경우에는, 20% EtOH 을 이용하여, Column내의 공기를 최대한 제거를 해 주신 후, Column Packing Evaluation을 통하여 레진의 Quality 를 확인 하시는 것을 추천 드립니다. Adsorption chromatography (IEX, AC) 레진의 Dry는 Ligand 에 영향을 줄 가능성 또한 있어서, 사용하시기 전에, 샘플을 사용하여, Dry 전과 후의 크로마토그램 결과를 비교하는 과정이 필요합니다.
  • Chromatography Resin의 Matrix 별 최대 압력은 어떻게 다른가요?
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  • 레진의 유효기간은 어떻게 되나요?
    Cytiva에서 제공하는 레진 (resin)의 Expiry date란 사용하지 않은 레진을 기준으로 COA (Certificate of Analysis: 성적증명서)에 나온 기준값에 대해서 GE가 보증하는 기간을 의미합니다. 실제적으로 레진을 사용하실 때에는 이와는 별도로, 사용하는 정제 프로세스에 따라서 별도의 Lifetime study를 진행하셔서 최대로 사용할 수 있는 cycle을 검증해야 합니다. 이는 보통 Small scale에서 예측한 뒤에, Large scale에서 확인을 하는 방식으로 진행합니다. 각각의 타겟단백질과 불순물, 그리고 Cleaning 방식에 따라서 레진의 Lifetime은 달라지므로 고객이 직접 검증을 해주셔야 하며, GE에서는 각 레진마다 정제 프로세스 중에서 일반적으로 가장 가혹한 조건인 CIP (Cleaninig-in-Place)를 기준으로 해서 레진의 성능이 유지되는 기간을 조사하기도 합니다.

    BioProcess Chromatography media-Lifetime studies

    The lifetime of a chromatography media (resin) is dependent on the process where it is used. In-process materials such as product and other components are specific for each process. It is therefore important that lifetime investigation on the actual process is performed. Lifetime can be estimated in small scale cycling studies and later confirmed at manufacturing scale under a validation period.

    As part of GE Healthcare Life Sciences development program for new BioProcess chromatography media, lifetime investigations are performed. The intention of the investigations is to decide on a CIP(Cleaning in Place) protocol that can be recommended and to prove the media lifetime for a specified number of CIP-cycles. Exposure to a CIP-protocol for a number of cycles with or without feed sample is investigated. Results from lifetime investigations are presented in the Regulatory Support File of a product and can be used by GE Healthcare customers to design a CIP –protocol and determine the lifetime of the chromatography media in their specific process.
  • Binding Capacity란 무엇인가요?
    컬럼으로 정제를 진행할 경우에 어느 정도의 샘플을 흡착할 수 있는지를 알아두어야 경제성을 고려한 실험조건을 마련할 수 있습니다. 결합능력(Binding Capacity)이란 해당 레진이 타겟단백질과 결합할 수 있는 능력을 말하며 크게 정적 결합능력 (Static Binding Capacity, SBC)와 동적 결합능력 (Dynamic Binding Capacity, DBC)로 나눕니다. SBC는 레진자체가 샘플과 결합할 수 있는 최대 능력이라고 생각하면 되고, DBC는 일정한 실험조건에서의 결합할 수 있는 능력으로 볼 수 있으며, 실제 실험에서는 사용하시는 레진에 따른 샘플의 DBC를 알고 계시는 것이 좋습니다. 이유는 결합능력에 비해 너무 적은 샘플을 로딩할 경우에는 컬럼의 결합능력을 다 사용하지 못하고, 너무 많은 샘플을 로딩할 경우에는 타겟단백질이 결합하지 못한 채 버려질 수 있기 때문입니다.

    DBC는 컬럼에 모든 타겟단백질이 결합된 후, 용출되기 시작하는 시점을 측정해서 얻는 값이며, 일반적으로 로딩한 타겟 단백질의 10%의 농도가 측정되는 시점을 기점 (Q10%: Binding Capacity at 10% Breakthrough point)으로 잡습니다.
  • Column에서의 Scale up은 어떻게 하나요?
    크로마토그래피는 기본적으로 단백질과 레진 (resin)의 성격에 따라서 흡착과 비흡착으로 나눌 수 있습니다. 즉 화학적 성질 (정전기적 인력, 소수성,친화성 등)을 이용해서 레진과 흡착시킨 뒤 용출시키거나, 물리적인 성질 (크기, 모양)을 이용해서 분리 정제를 진행하게 됩니다.

    일반적으로 연구소에서 타겟단백질과 불순물의 특성에 따라 컬럼/레진/버퍼를 선택하고 유속/전도도/염농도 등의 실험조건을 개발 및 최적화한 후에,필요에 따라서 파일럿 또는 생산스케일로 하는데, 이것을 scale up이라고 합니다.

    기본적으로 정제하고자 하는 타겟단백질의 양이 증가하게 되면 정제를 위한 컬럼의 크기도 같이 커져야 합니다. 그 경우, 일반적으로 컬럼직경과 컬럼높이 중 컬럼직경을 늘이는 방식으로 진행합니다. 이유는 컬럼높이를 증가하게 되면 유속에 따른 머무름시간이나 샘플이 통과하는 경로가 변동이 되어서 크로마토그래피의 패턴이 바뀔 수 있기 때문입니다.

    그렇기 때문에 선속도와 컬럼높이를 유지한다면 타겟단백질은 큰 컬럼에서도 작은 컬럼에서와 거의 동일한 조건을 갖게 되기 때문에 컬럼부피의 비율에 따른 크로마트그래피의 패턴을 유지할 수 있습니다.

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    추가고려사항에 있는 벽면효과 (Wall effect)란 직경이 커질수록 연성 또는 반경성의 레진은 유속에 따라 충진된 베드의 높이가 균일하게 유지되기 어렵다는 것으로, 이는 컬럼높이가 분리능에 직결되는 젤여과크로마토그래피의 경우에 영향을 많이 주기때문에 그림과 같이 섹션을 나누어 진행하는 것을 추천합니다.

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  • Chromatographic Specification 중의 Linear Flowrate(cm/h)는 무엇을 이야기 하는 것인가요?
    기본적으로 많이 사용하시는 것은 단위시간당 얼마만큼의 용액을 흘리는 것에 대한 volumetric flowrate를 많이 사용합니다. 다만 컬럼의 경우에는 컬럼의 높이 자체가 정제에 대한 부분과 연계가 많이 되기 때문에 컬럼의 높이에 대한 흐름의 속도를 linear flowrate 즉 선속도라고 이야기를 합니다. 부피는 높이와 단면적의 곱이기 때문에 Volumetric flowrate도 linear flowrate와 단면적의 곱으로 나타나지며, 반대로는 volumetric flowrate를 단면적으로 나누면 linear flowrate가 나옵니다.

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    예를 들면 Q sepharose fastflow media는 일반적으로 최대 500cm/h까지 사용할 수 있지만 일반적으로는 50~300cm/h로 사용하며, 이를 XK16 컬럼에서 사용할 경우에는 1.7~10ml/min이고, BPG100 컬럼에서 사용할 경우에는 65~392.5ml/min정도로 사용하시게 되는 것입니다. 만일 300cm/h로 10cm 컬럼에서 사용할 경우에는 컬럼의 입구에서 출구까지 걸리는 시간이 2분 정도가 걸리는 것이며, 이를 residence time (머무름 시간)이라고 합니다.

    각 레진에의 datasheet에는 각 레진이 사용될 수 있는 최대 linear flowrate 들을 대략적으로 표시하여 허용유속에 대한 기본 정보를 드립니다. 다만 시료나 용액의 점도, 또는 컬럼 사이즈에 따라 각 레진의 허용유속은 달라질 수 있음을 명심해주십시오.

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