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Chromatography 관련 자주 묻는 질문과 그에 대한 답을 확인해보세요.

  • Chromatography Resin의 Matrix 별 최대 압력은 어떻게 다른가요?
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  • 레진의 유효기간은 어떻게 되나요?
    Cytiva에서 제공하는 레진 (resin)의 Expiry date란 사용하지 않은 레진을 기준으로 COA (Certificate of Analysis: 성적증명서)에 나온 기준값에 대해서 GE가 보증하는 기간을 의미합니다. 실제적으로 레진을 사용하실 때에는 이와는 별도로, 사용하는 정제 프로세스에 따라서 별도의 Lifetime study를 진행하셔서 최대로 사용할 수 있는 cycle을 검증해야 합니다. 이는 보통 Small scale에서 예측한 뒤에, Large scale에서 확인을 하는 방식으로 진행합니다. 각각의 타겟단백질과 불순물, 그리고 Cleaning 방식에 따라서 레진의 Lifetime은 달라지므로 고객이 직접 검증을 해주셔야 하며, GE에서는 각 레진마다 정제 프로세스 중에서 일반적으로 가장 가혹한 조건인 CIP (Cleaninig-in-Place)를 기준으로 해서 레진의 성능이 유지되는 기간을 조사하기도 합니다.

    BioProcess Chromatography media-Lifetime studies

    The lifetime of a chromatography media (resin) is dependent on the process where it is used. In-process materials such as product and other components are specific for each process. It is therefore important that lifetime investigation on the actual process is performed. Lifetime can be estimated in small scale cycling studies and later confirmed at manufacturing scale under a validation period.

    As part of GE Healthcare Life Sciences development program for new BioProcess chromatography media, lifetime investigations are performed. The intention of the investigations is to decide on a CIP(Cleaning in Place) protocol that can be recommended and to prove the media lifetime for a specified number of CIP-cycles. Exposure to a CIP-protocol for a number of cycles with or without feed sample is investigated. Results from lifetime investigations are presented in the Regulatory Support File of a product and can be used by GE Healthcare customers to design a CIP –protocol and determine the lifetime of the chromatography media in their specific process.
  • Binding Capacity란 무엇인가요?
    컬럼으로 정제를 진행할 경우에 어느 정도의 샘플을 흡착할 수 있는지를 알아두어야 경제성을 고려한 실험조건을 마련할 수 있습니다. 결합능력(Binding Capacity)이란 해당 레진이 타겟단백질과 결합할 수 있는 능력을 말하며 크게 정적 결합능력 (Static Binding Capacity, SBC)와 동적 결합능력 (Dynamic Binding Capacity, DBC)로 나눕니다. SBC는 레진자체가 샘플과 결합할 수 있는 최대 능력이라고 생각하면 되고, DBC는 일정한 실험조건에서의 결합할 수 있는 능력으로 볼 수 있으며, 실제 실험에서는 사용하시는 레진에 따른 샘플의 DBC를 알고 계시는 것이 좋습니다. 이유는 결합능력에 비해 너무 적은 샘플을 로딩할 경우에는 컬럼의 결합능력을 다 사용하지 못하고, 너무 많은 샘플을 로딩할 경우에는 타겟단백질이 결합하지 못한 채 버려질 수 있기 때문입니다.

    DBC는 컬럼에 모든 타겟단백질이 결합된 후, 용출되기 시작하는 시점을 측정해서 얻는 값이며, 일반적으로 로딩한 타겟 단백질의 10%의 농도가 측정되는 시점을 기점 (Q10%: Binding Capacity at 10% Breakthrough point)으로 잡습니다.
  • Column에서의 Scale up은 어떻게 하나요?
    크로마토그래피는 기본적으로 단백질과 레진 (resin)의 성격에 따라서 흡착과 비흡착으로 나눌 수 있습니다. 즉 화학적 성질 (정전기적 인력, 소수성,친화성 등)을 이용해서 레진과 흡착시킨 뒤 용출시키거나, 물리적인 성질 (크기, 모양)을 이용해서 분리 정제를 진행하게 됩니다.

    일반적으로 연구소에서 타겟단백질과 불순물의 특성에 따라 컬럼/레진/버퍼를 선택하고 유속/전도도/염농도 등의 실험조건을 개발 및 최적화한 후에,필요에 따라서 파일럿 또는 생산스케일로 하는데, 이것을 scale up이라고 합니다.

    기본적으로 정제하고자 하는 타겟단백질의 양이 증가하게 되면 정제를 위한 컬럼의 크기도 같이 커져야 합니다. 그 경우, 일반적으로 컬럼직경과 컬럼높이 중 컬럼직경을 늘이는 방식으로 진행합니다. 이유는 컬럼높이를 증가하게 되면 유속에 따른 머무름시간이나 샘플이 통과하는 경로가 변동이 되어서 크로마토그래피의 패턴이 바뀔 수 있기 때문입니다.

    그렇기 때문에 선속도와 컬럼높이를 유지한다면 타겟단백질은 큰 컬럼에서도 작은 컬럼에서와 거의 동일한 조건을 갖게 되기 때문에 컬럼부피의 비율에 따른 크로마트그래피의 패턴을 유지할 수 있습니다.

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    추가고려사항에 있는 벽면효과 (Wall effect)란 직경이 커질수록 연성 또는 반경성의 레진은 유속에 따라 충진된 베드의 높이가 균일하게 유지되기 어렵다는 것으로, 이는 컬럼높이가 분리능에 직결되는 젤여과크로마토그래피의 경우에 영향을 많이 주기때문에 그림과 같이 섹션을 나누어 진행하는 것을 추천합니다.

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  • Chromatographic Specification 중의 Linear Flowrate(cm/h)는 무엇을 이야기 하는 것인가요?
    기본적으로 많이 사용하시는 것은 단위시간당 얼마만큼의 용액을 흘리는 것에 대한 volumetric flowrate를 많이 사용합니다. 다만 컬럼의 경우에는 컬럼의 높이 자체가 정제에 대한 부분과 연계가 많이 되기 때문에 컬럼의 높이에 대한 흐름의 속도를 linear flowrate 즉 선속도라고 이야기를 합니다. 부피는 높이와 단면적의 곱이기 때문에 Volumetric flowrate도 linear flowrate와 단면적의 곱으로 나타나지며, 반대로는 volumetric flowrate를 단면적으로 나누면 linear flowrate가 나옵니다.

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    예를 들면 Q sepharose fastflow media는 일반적으로 최대 500cm/h까지 사용할 수 있지만 일반적으로는 50~300cm/h로 사용하며, 이를 XK16 컬럼에서 사용할 경우에는 1.7~10ml/min이고, BPG100 컬럼에서 사용할 경우에는 65~392.5ml/min정도로 사용하시게 되는 것입니다. 만일 300cm/h로 10cm 컬럼에서 사용할 경우에는 컬럼의 입구에서 출구까지 걸리는 시간이 2분 정도가 걸리는 것이며, 이를 residence time (머무름 시간)이라고 합니다.

    각 레진에의 datasheet에는 각 레진이 사용될 수 있는 최대 linear flowrate 들을 대략적으로 표시하여 허용유속에 대한 기본 정보를 드립니다. 다만 시료나 용액의 점도, 또는 컬럼 사이즈에 따라 각 레진의 허용유속은 달라질 수 있음을 명심해주십시오.
  • 크로마토그래피 미디아 (레진)에서 Compression Factor는 무엇인가요?
    레진중에서도 탄성을 가지고 있는 경우, 유속이나 용액의 점도에 따라 컬럼 내부에 걸리는 압력이 달라질 수 있습니다. 이러한 경우, 걸리는 압력에 따라서 레진이 압축되었다가 압력이 풀리게 되면 원래의 상태로 돌아오기 때문에 충진된 레진의 높이가 유속이나 조건에 따라 달라질 수 있고 클리닝을 위해 Reverse flow로 흘리게 되는 경우 충진된 베드가 움직이면서 내부의 팩킹 상태가 변화할 수 있게 됩니다. 그렇기 때문에 초반에 사용조건보다 높은 압력 또는 최대 팩킹압력 등을 적용하여 적절한 압축도를 가지고 팩킹을 진행하게 되는 경우에는 이러한 부분의 문제를 감소시킬 수 있게 됩니다. Compression factor는 중력으로만 가라앉은 것 대비 실제로 팩킹되어야 하는 비율을 이야기 한 것으로 아래의 식에 대입됩니다.

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    일반적으로 가장 많이 사용되시는 sepharose 계열의 레진의 경우는 1.15의 Compression factor 값을 가지게 되며 팩킹시에는 슬러리 농도와 compression factor를 모두 고려한 양을 준비해주셔야 합니다.

    예를 들어 XK16/20에 10cm 정도로 Q sepharose fastflow 레진을 팩킹할 경우, 50%의 슬러리 (전체 슬러리 중 레진이 50%의 부피를 차지)의 경우에는 실제 컬럼부피를 슬러리 농도로 나누어준 다음, 압축되어야 할 compression factor 만큼이 더 필요한 것입니다.

    즉, 컬럼부피 = 단면적 (2㎠) * 높이 (10cm) = 10c㎤ = 10ml

    필요한 레진양 = 컬럼부피 (10ml) * Compression factor (1.15) = 11.5 ml

    필요한 슬러리양 = 필요한 레진양 (11.5ml) / 슬러리 농도 (0.5) = 23 ml 로

    실제로 필요한 레진양은 11.5ml로서 50%의 슬러리 23ml가 실제 팩킹을 위해 필요합니다.
  • 컬럼을 팩킹했는데, 제대로 팩킹한 것인지, 또는 오래동안 보관했던 컬럼을 사용해도 되는 것인지 어떻게 하면 알 수 있나요?
    컬럼팩킹을 한 뒤에나 오래도록 보관되었던 컬럼은 제대로 팩킹이 되었거나 유지되어 있는지에 대해 살펴볼 필요가 있으며, 일반적으로는 흡광도나 전도도의 변화를 가지고 이론단수나 비대칭성을 통해서 컬럼의 효율성을 평가하게 됩니다.

    추가적으로 오래도록 보관이 되어있던 경우에는 보관 전 클리닝 되었던 상태에 따라서 오염이 되는 경우가 있으므로 사용하기 전에 깨끗하게 클리닝을 한 뒤에 사용을 하시는 것이 좋고, 장기 보관시에도 주기적으로 보관용액을 갈아주시는 것이 좋습니다.
  • 컬럼 팩킹에 대해서 알려주세요.
    컬럼은 기본적으로 충진되는 크로마토그래픽 미디아 (레진)의 특성에 따라서 제대로 된 성능이나 장기적인 사용을 위해 적절하게 팩킹이 되어야 합니다. 그렇기 때문에 컬럼팩킹은 사용되는 레진과 컬럼의 타입에 따라서 팩킹방법이 적절히 선택이 되어야 하며, 기본적으로는 Flow/pressure 방법을 사용하여 빈 컬럼의 튜브내부에 적절한 농도의 레진슬러리를 부어준 뒤에 상단 아답터를 통해 팩킹용액을 일정유속, 또는 일정압력을 주어 팩킹을 진행하게 됩니다.

    팩킹이 제대로 진행이 되어야 하는 이유는 컬럼의 타입이나 레진의 특성 또는 사용될 조건을 고려하지 않은 채 팩킹이 되면, 분리효능자체에도 문제가 생길 수 있으며, 사용하면서 컬럼 내부 상태가 변하거나 레진이 변성될 수 있기 때문입니다.
  • [크로마토그래피 용 액세서리] Superloop (슈퍼 루프)의 보관 방법에 대해 가르쳐주세요.
    Superloop는 납품시에는 임시 조립 한 상태로 팩킹되어 있습니다.
    사용 후에는 물 등으로 세척하고 분해하여 건조시킨 상태로 보관합니다.
    또한, 유리관 세척 브러시를 사용하지 마십시오.
    상처가 들어간 경우 유리관의 강도가 저하 될 수 있습니다.

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