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Chromatography 관련 자주 묻는 질문과 그에 대한 답을 확인해보세요.

  • [ÄKTAexplore / purifier / FPLC] P-950 샘플 펌프를 사용하여 컬럼에 직접 자동 샘플 충전 (Sample Pump direct loading)을 할 경우 샘플의 손실은 어느 정도입니까?
    추천의 튜빙을 연결하는 경우에는 샘플 입구 관에서 분사 밸브까지 남아 샘플은 5 ml 정도입니다. 샘플의 손실을 피하기 위해 샘플 루프에 대한 샘플 작성은 수동 조작으로 할 것을 추천합니다.
  • [ÄKTAexplore / purifier / FPLC] Fraction 설정에서 Peak fraction을 선택하여 UV 레벨 값을 설정했지만, 용출시 UV 레벨 값이 설정 값을 넘기고 있는데도 Fraction이 시작하지 않습
    1) Peak fraction은 설정 한 수준 (mAU)의 값을 넘어선 때부터 피크로 인식합니다. 이미 UV 레벨 값이 설정 한 값을 넘긴 상태에서 용출이 시작된 경우 피크 인식되지 않으므로 일단 Peek fraction에서 설정 한 값보다 UV 레벨 값이 내려갈 때까지 비 흡착 시료를 씻어내야합니다 .
    2) UV-900의 경우, 첫 번째 피크 값을 바탕으로 Peak fraction 합니다. 첫째 peak보다 제 2, 제 3 peak의 UV 레벨 값이 큰 경우는 1 peak의 값을 변경합니다.
  • [ÄKTAexplore / purifier / FPLC] 컬럼 없이 flow를 흘렸을 때 압력이 높습니다. (DW 실온, 1 m / min로 0.35MPa 이상이됩니다).
    시스템 part 혹은 튜빙 중 어디가 막혀 있을 수 있습니다. 각 연결부를 차례로 분리 및 압력을 체크하여 위치를 확인합니다. 주요 원인으로 온라인 필터(mixer 내 장착) 및 FR-902 에서 막힘이 있을 수 있고, 튜빙이 꺽임이나 밸브내 염이 침착되어 있을 수 있습니다.
  • ÄKTA를 사용해서 정제할 때 유용한 connectors를 소개해 주세요.
    [ÄKTA Accessories 어플의 Fittings에서 더 많은 connectors를 확인하시기 바랍니다.

    atka_appatka_app_1
  • GST-tagged protein을 어떻게 정제할 수 있을까요?
    [GST-tagged Protein의 정제과정]

    [1] 정제도
    • PreScission Protease를 사용해서 GST-tagged proteins을 정제하는 방법
    gst2
    • Thrombin이나 Factor Xa을 사용해서 GST-tagged proteins을 정제하는 방법
    gst1 * 이미지 크게 보기

    [2] Cleavage enzyme에 따른 구분

    faq1

    더 자세한 내용은 자료실-Chromatography 페이지의 Affinity Chromatography vol.2 핸드북의 chapter 5를 참고하시기 바랍니다.
  • Sephadex resin을 어떻게 사용할 수 있는지 알려주세요.
    Cytiva 실험길라잡이 자료실 내 Chromatography 페이지의 [All about Sephadex 설명서]를 참고하세요.

    바로 가기
  • Buffer 가 부족하여, Column 이 완전히 Dry 되었습니다. Column 을 재 사용 할 수 있을까요?
    어떠한 종류의 Column도 Dry 되기 전의 Column Performance를 재현하기가 매우 힘듭니다. Gel filtration (GF) Column 의 경우, Packed Bed의 상태에 따라 크로마토그램의 분리능에 큰 영향을 주는 Chromatography column이기 때문에, 레진이 Dry 되면 Packed Bed에 Cracking을 형성 할 수 있어서, 재 기능을 잃을 수 있습니다. 그렇기 때문에, Re-Packing을 추천 드립니다. Cracking 의 형성은 또한, Ion Exchange chromatography (IEX)와 Affinity chromatography (AC) 에도 영향을 줍니다. 재 사용을 원하실 경우에는, 20% EtOH 을 이용하여, Column내의 공기를 최대한 제거를 해 주신 후, Column Packing Evaluation을 통하여 레진의 Quality 를 확인 하시는 것을 추천 드립니다. Adsorption chromatography (IEX, AC) 레진의 Dry는 Ligand 에 영향을 줄 가능성 또한 있어서, 사용하시기 전에, 샘플을 사용하여, Dry 전과 후의 크로마토그램 결과를 비교하는 과정이 필요합니다.
  • Chromatography Resin의 Matrix 별 최대 압력은 어떻게 다른가요?
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  • 레진의 유효기간은 어떻게 되나요?
    Cytiva에서 제공하는 레진 (resin)의 Expiry date란 사용하지 않은 레진을 기준으로 COA (Certificate of Analysis: 성적증명서)에 나온 기준값에 대해서 Cytiva가 보증하는 기간을 의미합니다. 실제적으로 레진을 사용하실 때에는 이와는 별도로, 사용하는 정제 프로세스에 따라서 별도의 Lifetime study를 진행하셔서 최대로 사용할 수 있는 cycle을 검증해야 합니다. 이는 보통 Small scale에서 예측한 뒤에, Large scale에서 확인을 하는 방식으로 진행합니다. 각각의 타겟단백질과 불순물, 그리고 Cleaning 방식에 따라서 레진의 Lifetime은 달라지므로 고객이 직접 검증을 해주셔야 하며, Cytiva에서는 각 레진마다 정제 프로세스 중에서 일반적으로 가장 가혹한 조건인 CIP (Cleaninig-in-Place)를 기준으로 해서 레진의 성능이 유지되는 기간을 조사하기도 합니다.

    BioProcess Chromatography media-Lifetime studies

    The lifetime of a chromatography media (resin) is dependent on the process where it is used. In-process materials such as product and other components are specific for each process. It is therefore important that lifetime investigation on the actual process is performed. Lifetime can be estimated in small scale cycling studies and later confirmed at manufacturing scale under a validation period.

    As part of Cytiva development program for new BioProcess chromatography media, lifetime investigations are performed. The intention of the investigations is to decide on a CIP(Cleaning in Place) protocol that can be recommended and to prove the media lifetime for a specified number of CIP-cycles. Exposure to a CIP-protocol for a number of cycles with or without feed sample is investigated. Results from lifetime investigations are presented in the Regulatory Support File of a product and can be used by Cytiva customers to design a CIP –protocol and determine the lifetime of the chromatography media in their specific process.
  • Binding Capacity란 무엇인가요?
    컬럼으로 정제를 진행할 경우에 어느 정도의 샘플을 흡착할 수 있는지를 알아두어야 경제성을 고려한 실험조건을 마련할 수 있습니다. 결합능력(Binding Capacity)이란 해당 레진이 타겟단백질과 결합할 수 있는 능력을 말하며 크게 정적 결합능력 (Static Binding Capacity, SBC)와 동적 결합능력 (Dynamic Binding Capacity, DBC)로 나눕니다. SBC는 레진자체가 샘플과 결합할 수 있는 최대 능력이라고 생각하면 되고, DBC는 일정한 실험조건에서의 결합할 수 있는 능력으로 볼 수 있으며, 실제 실험에서는 사용하시는 레진에 따른 샘플의 DBC를 알고 계시는 것이 좋습니다. 이유는 결합능력에 비해 너무 적은 샘플을 로딩할 경우에는 컬럼의 결합능력을 다 사용하지 못하고, 너무 많은 샘플을 로딩할 경우에는 타겟단백질이 결합하지 못한 채 버려질 수 있기 때문입니다.

    DBC는 컬럼에 모든 타겟단백질이 결합된 후, 용출되기 시작하는 시점을 측정해서 얻는 값이며, 일반적으로 로딩한 타겟 단백질의 10%의 농도가 측정되는 시점을 기점 (Q10%: Binding Capacity at 10% Breakthrough point)으로 잡습니다.

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