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Chromatography 관련 자주 묻는 질문과 그에 대한 답을 확인해보세요.

  • [NEW] 컬럼 팩킹 후 컬럼 효율 평가를 위해 추천하는 유속과 샘플 볼륨이 있을까요?
    컬럼 효율성 평가는 사용하고자 하는 용매에 1~2% Acetone 또는 NaCl 을 샘플로 주입하여 흡광도 혹은 전도도의 peak 을 통해 평가합니다.
    샘플과 사용할 완충액은 레진 종류에 따라 선택하시면 됩니다. 아래 테이블 참고하시기 바랍니다.



    컬럼 효율성 평가에서 유속은 Peak broadening 에 큰 영향을 미칩니다.
    입자 크기는 최적의 유속을 설정하기 위해 중요한 요소 이므로, 아래 표를 참고하여 유속을 설정하시기 바랍니다.



    샘플 볼륨은 일반적으로 컬럼 볼륨(Column volume) 의 1% 를 권장 드립니다. 다만, 사용하는 장비나 물질에 따라 편차가 있을 수 있습니다.
  • [NEW] HisTrap 컬럼이 갈색으로 변했습니다. 컬럼을 사용해도 괜찮을까요?
    컬럼이 갈색으로 변한 이유는 레진 내에 느슨하게 결합되어 있던 Ni 2+ 이온이 환원제가 만나 환원되면서 변합니다.
    정제를 하기 전에, 환원제가 없는 완충액을 사용하여 Blank run 을 돌려서 컬럼 내 남아있던 Ni2+ 이온을 씻어주는 것을 권장 드립니다. 만약 이미 변색되었다면, 아래와 같은 방법을 통해 washing 할 수 있습니다.

    1. 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4 (Stripping buffer) 를 최소 3CV 만큼 흘려 세척합니다.
    2. 유속을 멈춘 상태에서 over night 동안 Incubation 합니다.
    3. Binding buffer -> DW 순서로 세척합니다.
    4. (옵션사항) 추가적인 세척을 원한다면, 1 M NaOH -> Binding buffer -> DW 순서로 세척합니다.
    5. 0.1 M NiSO4 in distilled water (Recharging buffer) 을 컬럼의 매뉴얼에서 권장하는 양만큼 흘려줍니다.
    6. 5 CV 의 DW -> 5 CV 의 binding buffer (to adjust pH) 순서로 세척 후 20% EtOH 을 흘려 보관합니다.
  • [NEW] 컬럼을 구매하려고 합니다. 컬럼 이름 뒤에 GL, PE 이라고 적혀 있는데, 그 의미가 궁금합니다.
    Pre-packed column 의 경우 컬럼 이름이 5/50 GL, 10/100 GL, 4.6/100 PE 등으로 명시된 것을 보실 수 있습니다.
    앞 숫자는 컬럼의 직경(mm), / 뒤의 숫자는 컬럼 높이(mm) 라고 생각하시면 됩니다. GL, PE는 컬럼의 재질로, 각각 Glass 와 PEEK 을 의미합니다. 직경이 4.6 mm 인 경우 PEEK 재질로 만들어져 높은 압력에도 견딜 수 있습니다.
  • 단백질 정제 시 purity와 resolution 문제는 어떻게 해결하나요?
    링크된 페이지를 통해, 단백질 정제 시 purity, resolution issue 해결 방법을 확인해보세요.
  • MabSelect VL 레진은 어떤 제품인가요?
    Fab나 이중 항체(Bispecific Ab) 등 Kappa light chain을 내재하고 있는 변형 항체를 정제할 때 사용할 수 있는 Protein L 친화 크로마토그래피 레진으로 항체 종류의 다양성이 높아지면서, 이러한 변형 항체들에 대한 정제 수요가 커지고 있습니다. MabSelect VL은 Protein A 레진의 대체제로서 Fabs, 이중 항체 등 kappa light chain을 내재하고 있는 다양한 변형 항체들의 Capture 단계에서 유용하게 사용될 수 있습니다.
    높은 DBC(Dynamic binding capacity)를 통해 정제하고자 하는 물질을 효율적으로 정제할 수 있으며, 0.1M NaOH 세척 환경에서도 안정적이기 때문에 바이오 버든으로 인한 오염 위험을 줄일 수 있습니다. 이중 항체 정제의 첫 번째 capture단계에서 타겟 관련 불순물들에 대한 높은 해상도를 제공합니다.
  • Kinetics assay에 sensor chip PrismA 를 사용할 수 있을까요?
    Kinetics assay에는 sensor chip PrismA를 권장하지 않습니다.

    본 chip은 human IgG 항체 농도 분석 및 스크리닝에 사용되는 것을 권장하고 있습니다.

    Kinetics assay 를 수행하고자 한다면, Series S Sensor Chip Protein A 를 사용하시면 됩니다.
  • 권장하는 Sensor chip PrismA 의 regeneration condition은 무엇입니까?
    10mM 글리신-HCl, pH 1.5의 60s, 50mM NaOH의 120s 가 권장되는 조건입니다.

    물론 ligand와 analyte의 상태에 따라 조정이 필요할 수도 있습니다.
  • PrismA 리간드는 Human IgG의 어느 부분에 결합합니까?
    Protein A chip의 경우에는 CH2와 CH3에 binding affinity 가 존재하지만,  PrismA의 경우는 Main binding affinity 는 CH2와 CH3에 있지만 VH3에도 Binding affinity가 있습니다.

    PrismA Human IgG
  • His-tagged 단백질의 회수율이 낮은 경우 어떠한 사항을 고려해야 하나요?
    세포배양배지에 포함되어 있는 많은 components는 IMAC 수지와 호환되지 않기 때문에 단백질 정제의 수율을 낮추게 됩니다.

    이는 샘플을 로딩하는 동안 IMAC 레진에 고정화 되어 있는 metal ions이 스트립핑이 되기 때문에 점점 binding affinity가 약하게 되기 때문입니다.

    이러한 경우는 EDTA에 내구성이 강한 레진, Ni Sepharose excel 제품으로 교체를 하면 해결이 될 수도 있습니다.

    Ni Sepharose
  • Mammalian cell line에서 유래한 his-tagged 단백질을 정제하려고 합니다. 어떠한 제품을 구매하면 될까요?
    Ni Sepharose Excel은 이러한 Application 에 사용할 수 있는 제품입니다.

    Cell culture 배지에는 일부 EDTA 유사 시약 및 Ni+ 이온을 제거하는 물질들을 포함하고 있는데, Ni Sepharose Excel은 EDTA 및 DTT와 같은 환원제에 대해 매우 높은 내성을 가지고 있습니다.

    따라서 Ni Sepharose Excel을 이용한다면, 금속 이온 스트리핑을 유발하는 물질을 포함한 배지를 제거하지 않고 샘플을 바로 로딩 할 수 있으므로 워크플로우를 크게 단순화 할 수 있습니다.

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