SPR

Biacore 실험에서 chip 표면에 부착하는 물질을 ligand(리간드)라고 합니다.

리간드로 사용하면 좋은 조건은, Tagged protein, 단백질의 양이 적은 샘플, 순도가 높은 샘플, 분자량이 작은 단백질을 우선적으로 chip  표면에 부착을 하는 것이 좋습니다.

네, 막단백질은  Detergent solubilization과 나노 디스크와 같은 다양한 방법 처리하여 측정이 가능합니다.

또한 detergent 없이 막 단백질 용해도를 유지하는 양친매성폴리머(amphipols)를 사용한다면, 바이오틴 태그를 활용하여 sensor chip SA로 캡쳐하여 실험이 가능합니다.

Biacore 8K와 Biacore S200은 모두 매우 민감한 기기입니다. 분자량에 대한 하한선은 없으며 매우 넓은 동적 범위와 낮은 RU 수준에서 kinetics를 측정할 수 있습니다.

그러나 Biacore S200은 background noise가 약간 낮고 데이터 수집 속도가 40Hz입니다.

즉, Biacore S200에서 더 빠른 바인딩을 캡처할 수 있고 mRU 수준에서 더 나은 해상도를 얻을 수도 있습니다.

이러한 특징은 매우 낮은 리간드 고정화 레벨과 활성화가 적은 단백질인 경우에 유리합니다. 대부분의 응용 분야에서 두 기기는 감도와 관련하여 동일합니다.

fragment의 2차 상호 작용 및 기타 유형의 원치 않는 상호작용은 더 높은 농도에서 감지하기가 쉽습니다.

따라서 고농도에서 스크리닝 실험을 수행하면 프로세스 초기에 이러한 원치 않는 상호작용을 쉽게 식별 할 수 있으므로 후속 실험에서 시간을 절약할 수 있습니다.

ligand 와 analyte의 친화력(KD)을 알면 결합의 평형농도, 즉 Complex의 50%가 형성이 되는 평형 농도를 알 수 있습니다.

예를 들어, KD=3.1 * 10^-9 이라고 하면, analyte의 농도를 3nM로 처리를 하게 되면, Rmax의 50%에 해당하는 RU에서 두 물질의 평형화가 된다는 의미입니다.

정확한 kd 측정을 위해서는 KD의 2배 정도가 되는 농도로 analyte로  처리를 해야 하고, Kinetics를 통한 kd/ka로 KD를 측정하려는 경우에는 0.1KD~10 or 100KD범위의 analyte 농도를 설정하는 것이 Data의 신뢰도를 높일 수 있습니다.

이러한 analyte처리 농도가 data의 신뢰도에 영향을 주기 때문에 KD를 안다는 것은 적당한 analyte 농도를 설정하는 것에 도움이 됩니다.

Biacore 사용에 참고하실 수 있는 동영상을 공유 드립니다.

<Biacore 튜토리얼 동영상>

• Biacore™ Tutorial: Preparing your sensor surface for capture based coupling
• Biacore™ Tutorial: Preparing your sensor surface for direct covalent coupling

 

<Biacore™ T200 관련 동영상>

• Biacore™ T200 system tutorial: Instrument start up
• Biacore™ T200 SPR system: How to get started
• Biacore™ T200 system tutorial: How to set up a kinetic assay
• Biacore™ T200 system tutorial: How to evaluate a kinetic assay
• Sensorgram comparison evaluation workflow: Biacore™ T200 Software v3.0
• Biacore™ T200 system tutorial: Instrument maintenance

고정된 리간드의 활성이 100%라는 가정하에 리간드와 분석물이 결합하였을때의 최대 RU 값을 Rmax라고 합니다.

Rmax를 구하는 식은 아래와 같습니다.

다시 말하면, 1:1 Binding model이라고 하면 최고 농도의 분석물을 주입하더라도 리간드와 분석물이 바인딩을 하여 나오는 RU가 Rmax 이상으로는 나올 수가 없습니다.

즉, 리간드와 분석물이 바인딩했을때 최고치의 RU를 Rmax라고 합니다.

• RL = Capture/immobilization level measured in RU.
• Rmax = Theoretical binding capacity of the surface.
• For kinetic measurements aim for Rmax < 30 RU.
• Sm = Stoichiometric ratio. If unknown, assume Sm = 1.

Ligand 의 고정량은 Ligand와 analyte의 molecular  weight 및 assay type에 따라서 결정이 됩니다.

그림에서 보시는 것처럼 assay development의 경우는 되도록이면 많은 양을 고정화 하여 binding 유무를 판단하는 것이 유리하고, kinetics 를 위해서는 되도록이면 고정화 level을 낮게 하시는 것이 유리합니다.

사용하는 Biacore model에 따라 권장하는 Rmax에 맞게 고정을 하시면 됩니다.

Ligand 와 analyte의 상호작용을 확인 하기 위한 적합한 sensor chip을 선택하는 것은 연구하려는 단백질과 다른 분자에 따라 크게 달라지게 됩니다.

그렇지만 일반적으로 선택 할 수 있는 방법에 대해 설명을 드리도록 하겠습니다.

1. Target 단백질에 tag가 있는 경우는 His, GST 및 Biotin tag을 통해 capture 할 수 있는 kit 및 chip의 dextran에 capture molecule을 미리 고정화 해 둔 chip을 선택할 수 있습니다.

2. Biotinylated ligand의 경우는 biotin CAPture Kit를 사용하면, 다양한 ligand를 사용할수 있으며 regeneration 조건을 찾지 않아도 되는 장점이 있습니다.

3. 마지막으로 CM5의 Chip의 경우는 아민 커플링으로 ligand를 고정하는 방법입니다. 이 방법은 ligand를 비교적 쉽게 고정할 수 있는 장점이 있지만 sensor chip표면을 재사용 하려면 regeneration 조건을 찾아야 합니다.

Pre-functionalized sensor surfaces

• Sensor Chip SA and Sensor Chip NA
• Sensor Chip Protein A, Sensor Chip G and
  Sensor Chip L
• Sensor Chip NTA
• Sensor Chip L1 and Sensor Chip HPA

Biacore™ capture kits – ready to go

• Biotin CAPture Kit
• Mouse Antibody Capture Kit
• Human Antibody Capture Kit
• Human Fab Capture Kit
• His Capture Kit
• GST Capture Kit

항체를 리간드로 사용하는 경우는 항체를 capturing 해주는 chip을 사용하시면 편리합니다.  그림1 을 보시면 chip의 CM dextran matrix에 Protein A, Protein G 또는 Protein L ligand를  공유결합으로 고정화를 해둔 칩입니다. 사용하시는 항체의 종과 type에 따라서 Sensor chip protein A,G 혹은 L을 선택하시면 됩니다.





그래서 항체를 흘려주기만 해도 그림 2에서 보시는 것과 같이 쉽게 같은 방향으로 항체를 고정화 할 수 있습니다. 그리고 바로 항원을 흘려주면 그림 3처럼 항체-항원의 상호작용을 확인 하실 수가 있습니다.

이 외에도 capture할수 있는 제품은 아래와 같습니다.

• Human Fab Capture kit : Fab fragments를 capture하기 위한 시약
• Mouse antibody capture kit :  mouse antibody를 capture하기 위한 시약
• Human antibody capture kit : human 혹은 humanized IgG antibodies를 capture 하기 위한 시약