SPR

Biacore 사용에 참고하실 수 있는 동영상을 공유 드립니다.

<Biacore 튜토리얼 동영상>

• Biacore™ Tutorial: Preparing your sensor surface for capture based coupling
• Biacore™ Tutorial: Preparing your sensor surface for direct covalent coupling

<Biacore™ T200 관련 동영상>

• Biacore™ T200 system tutorial: Instrument start up
• Biacore™ T200 SPR system: How to get started
• Biacore™ T200 system tutorial: How to set up a kinetic assay
• Biacore™ T200 system tutorial: How to evaluate a kinetic assay
• Sensorgram comparison evaluation workflow: Biacore™ T200 Software v3.0
• Biacore™ T200 system tutorial: Instrument maintenance

고정된 리간드의 활성이 100%라는 가정하에 리간드와 분석물이 결합하였을때의 최대 RU 값을 Rmax라고 합니다.

Rmax를 구하는 식은 아래와 같습니다.

다시 말하면, 1:1 Binding model이라고 하면 최고 농도의 분석물을 주입하더라도 리간드와 분석물이 바인딩을 하여 나오는 RU가 Rmax 이상으로는 나올 수가 없습니다.

즉, 리간드와 분석물이 바인딩했을때 최고치의 RU를 Rmax라고 합니다.

• RL = Capture/immobilization level measured in RU.
• Rmax = Theoretical binding capacity of the surface.
• For kinetic measurements aim for Rmax < 30 RU.
• Sm = Stoichiometric ratio. If unknown, assume Sm = 1.

Ligand 의 고정량은 Ligand와 analyte의 molecular  weight 및 assay type에 따라서 결정이 됩니다.

그림에서 보시는 것처럼 assay development의 경우는 되도록이면 많은 양을 고정화 하여 binding 유무를 판단하는 것이 유리하고, kinetics 를 위해서는 되도록이면 고정화 level을 낮게 하시는 것이 유리합니다.

사용하는 Biacore model에 따라 권장하는 Rmax에 맞게 고정을 하시면 됩니다.

Ligand 와 analyte의 상호작용을 확인 하기 위한 적합한 sensor chip을 선택하는 것은 연구하려는 단백질과 다른 분자에 따라 크게 달라지게 됩니다.

그렇지만 일반적으로 선택 할 수 있는 방법에 대해 설명을 드리도록 하겠습니다.

1. Target 단백질에 tag가 있는 경우는 His, GST 및 Biotin tag을 통해 capture 할 수 있는 kit 및 chip의 dextran에 capture molecule을 미리 고정화 해 둔 chip을 선택할 수 있습니다.

2. Biotinylated ligand의 경우는 biotin CAPture Kit를 사용하면, 다양한 ligand를 사용할수 있으며 regeneration 조건을 찾지 않아도 되는 장점이 있습니다.

3. 마지막으로 CM5의 Chip의 경우는 아민 커플링으로 ligand를 고정하는 방법입니다. 이 방법은 ligand를 비교적 쉽게 고정할 수 있는 장점이 있지만 sensor chip표면을 재사용 하려면 regeneration 조건을 찾아야 합니다.

Pre-functionalized sensor surfaces

• Sensor Chip SA and Sensor Chip NA
• Sensor Chip Protein A, Sensor Chip G and
  Sensor Chip L
• Sensor Chip NTA
• Sensor Chip L1 and Sensor Chip HPA

Biacore™ capture kits – ready to go

• Biotin CAPture Kit
• Mouse Antibody Capture Kit
• Human Antibody Capture Kit
• Human Fab Capture Kit
• His Capture Kit
• GST Capture Kit

항체를 리간드로 사용하는 경우는 항체를 capturing 해주는 chip을 사용하시면 편리합니다.  그림1 을 보시면 chip의 CM dextran matrix에 Protein A, Protein G 또는 Protein L ligand를  공유결합으로 고정화를 해둔 칩입니다. 사용하시는 항체의 종과 type에 따라서 Sensor chip protein A,G 혹은 L을 선택하시면 됩니다.





그래서 항체를 흘려주기만 해도 그림 2에서 보시는 것과 같이 쉽게 같은 방향으로 항체를 고정화 할 수 있습니다. 그리고 바로 항원을 흘려주면 그림 3처럼 항체-항원의 상호작용을 확인 하실 수가 있습니다.

이 외에도 capture할수 있는 제품은 아래와 같습니다.

• Human Fab Capture kit : Fab fragments를 capture하기 위한 시약
• Mouse antibody capture kit :  mouse antibody를 capture하기 위한 시약
• Human antibody capture kit : human 혹은 humanized IgG antibodies를 capture 하기 위한 시약

Biacore 사용기관은 다음과 같습니다.

Biacore T200

• Biocon (의약바이오컨버젼스연구단)

수원, 031-888-9267, https://service.biocon.re.kr/

• KBIO (오송첨단의료산업진흥재단)

오송, 043-200-9517

Biacore T100

• 서울대학교 기초과학공동기기원

서울, 02-880-6498, http://irf.snu.ac.kr/02_facility/36_spr_03

BIA3000

• 대전바이오벤처타운

대전, 042-930-4712, http://www.dbvt.or.kr/equipments/

• 나노종합기술원

대전, 042-366-1632, https://www.nnfc.re.kr/post/equipment

BIA2000

• 한국기초과학지원센터

서울, 02-6943-4132, http://use.kbsi.re.kr/

 

• R = response
• MW = molecular weight
• n = stoichiometry (analyte/ligand)

 

Rmax는 위의 식에 의해서 계산이 되어지며, Chip에 고정화 시킨 리간드가 analyte와 100%결합을 했을 때의 반응 RU를 의미합니다. 예를 들어 1:1 interaction에서 리간드와 analyte의 분자량이 각각50kDa, 100kDa인 단백질의 상호작용을 볼 때, 50kDa의 리간드를 50RU를 고정화 시키고 100kDa의 analyte를 흘려주었을 때, 최대 binding level은 Rmax인 100RU라는 의미 입니다.

Rmax의 설정 기준은 각 물질의 분자량, affinity에 따라 다르나, 대략 T series의 경우는 40RU

기본 교육은 getting started kit를 사용하여 CM5 Chip에 amine coupling 방법으로 고정화 하는 실험으로 진행을 합니다. 필요한 Biacore T Series와 3000에 대한 소모품 리스트는 아래 표와 같습니다.



소모품은 지역 담당 대리점을 통해 구매가 가능하며, 담당 대리점 연락처는 아래와 같습니다.

• 서울 지역: 동일과학 (02-2027-5630), 이효바이오싸이언스 (031-722-2382)
• 대전 지역: 비앤비 (042-488-0058)
• 경상 지역: 바이나리 (053-291-5012)

처음 시작하시는 분들은 getting started kit를 이용하여 기기 operation에 대해서 충분히 연습을 하신 후 sample을 이용하시는 것을 권장 드립니다.