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RPC는 분자와 크로마토그래피 레진의 소수성 표면 간의 가역적인 상호작용에 기초하여 소수성이 서로 다른 분자를 분리합니다. 시료는 컬럼 내로 주입되면서 결합합니다. 그 후 조건은 결합된 물질이 차별적으로 용출되도록 변화됩니다. 역상 매트릭스의 특성 상 흔히 아주 강하게 결합하며, 용출을 위해 유기 용매와 다른 첨가제(이온 결합제)의 사용이 필요합니다. 용출은 대개 유기 용매의 농도 증가로 이루어지며, 아세토나이트릴이 가장 흔하게 사용됩니다. 결합 과정에서 농축된 분자는 정제되고 농축된 형태로 회수됩니다. 분리의 주요 단계가 아래 그림에 나와 있습니다.

RPC는 올리고뉴클레오타이드와 펩티드의 최종 연마에서 종종 사용되며 펩티드 지도작성과 같은 분석적인 분리에 이상적입니다. 많은 단백질이 유기 용매에 노출되면 변성되기 때문에 만일 활성 회복과 정확한 3차 구조로의 복귀가 요구된다면 RPC는 단백질 정제에 추천되지 않습니다.

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리간드 소수성의 선택
요구되는 소수성 정도에 따라 중합체나 실리카 기반 매트릭스인 C4, C8 아니면 C18 n-alkyl hydrocarbon 리간드를 선택합니다. 소수성이 큰 분자는 소수성이 큰 리간드(예를 들면 C18)에 단단히 결합합니다. 여러 RPC 레진을 검사해봅니다. 시료가 소수성이 큰 성분(생체 분자 같은 경우)을 가진다면 소수성이 낮은 레진(예를 들면 C4 혹은 C8)부터 시작합니다. 최고의 용리와 주입 용량을 제공하는 레진을 선택합니다.

시료의 양과 용량
RPC는 시료의 양에 구애받지 않는 결합 방법입니다. 총 용량은 실험 조건과 매질, 시료의 성질에 많이 의존합니다. 구배용출 시 최적의 환경을 위해 용리를 감소시키지 않는 시료 주입량을 찾도록 합니다.

컬럼의 선택
RPC에서 소수성 리간드 뿐 아니라 크로마토그래피 매트릭스 또한 선택성에 영향을 미칩니다. 서로 다른 RPC 매질에 대한 선별이 추천됩니다. 역상 컬럼은 처음 사용할 때, 장기간 보관 후에 혹은 버퍼 시스템을 바꿀 때에 평형을 연장시킴으로써 ‘condition’시켜야 합니다.

시료 조제
시료에 입자상 물질(미세 먼지)이 없어야 하며, 가능하면 출발 버퍼(start buffer)에 용해시켜야 합니다. 시료가 불용성이라면 1) 10-30% acetic acid, 2) 70% formic acid, 3) 6 M guanidine-HCl, 4) 100% DMSO (dimethyl sulphoxide), 5) TFA (trifluoroacetic acid)를 시도해봅니다. DMSO에 용해된 소수성이 큰 펩티드는 침전하거나 RPC 매트릭스에 비가역적으로 결합할 수 있다는 것을 주의합니다. 먼저 시료의 부분 표본으로 시험해봅니다.

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