fbpx

HIC는 단백질의 소수성 차이에 따라 단백질을 분리합니다. 이러한 분리는 단백질과 크로마토그래피 레진의 소수성 표면 간의 가역적인 상호작용에 기초합니다. 이 상호작용은 높은 이온 강도를 가진 버퍼에 의해 향상되며, 그로 인해 HIC는 황산암모늄으로 침전되었거나 IEX로 고염에 용출된 단백질 정제를 위한 이상적인 ‘다음 단계’가 됩니다.

이온 강도가 높은 용액(예를 들면, 1.5 M NH2SO4) 내의 시료는 컬럼 내로 주입되자 마자 결합하게 됩니다. 그 후 조건이 변화되면 결합된 물질이 차별적으로 용출 됩니다. 용출은 주로 염 농도 감소에 의해 이루어집니다. 아래 그림과 같이 가장 일반적으로 황산암모늄의 감소 구배로 샘플을 용출 시킵니다. 표적 단백질은 결합되는 동안 농축되며, 정제되고 농축된 형태로 회수됩니다. 다른 용리 과정도 이용 가능합니다.

HIC img

소수성 리간드의 선택
다양한 리간드 중에서 선택합니다. 일반적으로 ether, isopropyl, butyl, octyl, phenyl의 순으로 단백질에 대한 리간드의 결합 강도가 증가합니다. 소수성이 큰 단백질은 높은 소수성의 리간드에 단단히 결합하게 됩니다.
몇 가지 소수성 레진을 검사해보도록 합니다. 만일 시료가 소수성이 큰 성분을 가진다면 낮은 소수성의 레진부터 시작합니다. 낮은 염농도에서 가장 양호한 용리와 로딩 용량을 부여하는 레진을 선택합니다.

시료의 양과 용량
구배 용출 시 최적의 분리를 위해 컬럼의 총 결합 용량의 약 1/5 정도를 사용합니다. HIC는 시료의 양에 구애받지 않는 결합 방법입니다.

컬럼의 선택
HIC를 이용할 때 소수성 리간드 뿐 아니라 크로마토그래피의 매트릭스도 선택성에 영향을 줍니다.
요구되는 규모에서의 시료 용해도, 정제의 규모, 올바른 리간드의 유용성과 같은 지표들을 고려해야 합니다. 적절한 컬럼을 찾고 실험 방법을 최적화하기 위해 HiTrap HIC Selection Kit나 RESOURCE™ HIC Test Kit를 사용합니다.

시료 조제
시료는 출발 버퍼(starting buffer)과 같은 pH를 가져야 하며, 이온 강도가 높은 용액 내에 있어야 합니다. 또한 입자상 물질(미세 먼지)이 없어야 합니다.

버퍼 조제
만일 소수성 특성이 알려져 있지 않다면, 다음의 조건을 먼저 시도해봅니다.

  • Start buffer (A): 50mM Na₂HPO₄ X 2H₂O pH 7,0 + 1.0M ammonium sulphate
  • Elution buffer (B): 50mM Na₂HPO₄ X 2H₂O pH 7,0
  • Gradient: 0-100% in 10-20 column volumes

Operation 관련 자료

Share This